一、实验准备

1、健康的HEK 293T细胞,一般使用复苏后10代以内的细胞进行慢病毒的生产，要求无细菌、真菌以及支原体污染；

2、转染试剂，如PEI，Higene、lipo2000或lipo3000

各种转染试剂的步骤稍有差别，小助手以PEI为转染试剂。

3、DMEM无血清无双抗培养基，DMEM完全培养基（10%FBS和1%P/S）；

4、10mL无菌注射器(环氧乙烷灭菌处理)；

5、0.45μm的细菌滤器。

二、包装步骤

Day1（7:00 PM）铺板HEK 293T细胞

数量：400万/10 cm dish ；觉得计数麻烦的话，可以在293T细胞长到约90%汇合时，1:5传代（均分成5份），每1份的数目差不多就是400万了。

Day2（3:00 PM）三质粒转染

在培养箱中恢复细胞状态约20h，此时可进行转染。三质粒的转染体系三种质粒的配比有许多种方式，目前MDL使用4:3:1的比例，即PxpAx2：PMD2g：PLVX(载有你基因的质粒)。10cm dish一般转染质粒的总质量为20μg，PEI的量为质粒的2.5-3倍（也就是50μg-60μg，一般推荐按照2.5倍来）。按照比例算下来，PxpAx2：PMD2g：PLVX的质量比为：(10ug:7.5ug:2.5ug)

注意：在提到质粒的量时，千万记得说质量而不是浓度，不然容易出错。

实验步骤：

取如上总质量为20μg的质粒添加到总体积500μL的DMEM无血清无双抗培养基中，记为A液，移液枪混匀20次；

取PEI(一般配置成1μg/mL)50-60μg（也就是50-60μL）添加到总体积500μL的DMEM无血清无双抗培养基中，记为B液，移液枪混匀20次；

将B液逐滴滴加到A液中，移液枪轻柔混匀66次，室温静置15-20min；

将静置好的转染试剂（A+B）缓缓滴加到恢复状态20h的HEK 293T细胞中。

做好标记，记好转染时间、转染质粒、换液时间等参数提高实验重复性。

Day3（9:00 AM）换液

转染后的第18h，将含有转染试剂的HEK 293T上清更换为10mL DMEM完全培养基；对于新手，为了防止你在换液时将细胞吹散，可以留3mL的液体在dish中，更换8mL DMEM完全培养基。

Day4（3:00 PM）收集病毒液

在转染后的48-72h，为病毒生产的高峰期，一般bwin·必赢收集转染后48h（换液后30h，产毒30h）的病毒液用于实验，足以满足大部分实验需求。收集病毒于15mL tube中，500g，5mL离心去细胞碎片和杂质，随后使用注射器和滤器进行过滤。收集后的病毒上清可以用来进行感染和储存。

三、慢病毒滴度测定

病毒滴度的单位为：TU/mL，代表每毫升病毒液中具有转导功能的病毒颗粒的数目。

计算公式为：滴度=（感染时细胞数（个）*阳性细胞%）/病毒液体积（mL）

病毒液体积和感染时细胞数已知，需通过流式细胞术确认阳性细胞百分比。

滴度测定常常使用HEK 293T细胞，大致的原理为，将在DAY3收集到的病毒上清，按照梯度添加到293T细胞中，感染后48h检测阳性细胞的比例，从而确定病毒的滴度。

四、注意事项

293T细胞的代数最好用15代以内，最多不超过20代，否则影响转染效率。质粒浓度在400-1000ng/μL范围，纯度260/280在1.8-2.0之间的转染效率较高。混合体轻轻滴入细胞上清后摇匀，动作要轻，293T细胞贴壁不牢避免细胞脱落。

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